Götz, Marc: Extrazelluläre Invertasen in Höheren Pflanzen : essentielle Funktionen während der Pollenentwicklung und -keimung / Marc Götz

Mit einem Geleitwort von Thomas Roitsch. - Taunusstein : Driesen, 2001 (Driesen Edition Wissenschaft). - 183 S. : Ill. ; 19 cm. Zugl.: Regensburg, Universität, Dissertation, 2001. ISBN 3-9807344-8-X kart., zahlreiche, teilweise farbige Abbildungen, EUR 23,00
Extrazelluläre Invertasen besitzen durch ihre Funktion eine zentrale Rolle in der Kohlenhydratverteilung in höheren Pflanzen. Durch ihre essentielle Stellung in der Assimilatverteilung über einen apoplastischen Phloementladungsweg beeinflussen Expression und Aktivität der extrazellulären Invertasen entscheidend Wachstum und Entwicklung von Pflanzen. Das Vorkommen verschiedener Isoformen innerhalb einer Pflanze und die unterschiedlichen zeitlichen und räumlichen Expressionsmuster dieser Isoformen unterstreichen die Bedeutung extrazellulärer Invertasen für diese Prozesse. Ein direkter Nachweis der Funktionen von extrazellulären Invertasen ist aufgrund ihrer zentralen Stellung für Wachstum und Entwicklung bislang schwierig gewesen. Die meisten erhaltenen Daten sind daher korrelativ.
Marc Götz kloniert den Promotor und das Strukturgen der extrazellulären Invertase Nin88 aus Antheren von Nicotiana tabacum und weist ein spezifisches zeitliches und räumliches Expressionsmuster von Nin88 in den Antheren und Pollen während der Pollenentwicklung nach. Diese eingeschränkte Expression innerhalb der reproduktiven Organe erlaubt eine direkte Untersuchung der Funktion von Nin88 ohne pleiotrope Effekte auf Wachstum und Entwicklung der Pflanze. Der Autor zeigt, dass die Reduktion der Aktivität von Nin88 durch Antisense-Repression und Expression eines Invertase-Inhibitorproteins zu Störungen während der Pollenentwicklung und -keimung führt, die durch mangelnde Kohlenhydratversorgung der Pollen das Entstehen männlich steriler Pflanzen nach sich zieht. Damit stellt die Störung der Kohlenhydratversorgung eine zwar subtile aber hoch effiziente biotechnologische Methode dar, um männliche Sterilität für praktische Anwendungen in der Landwirtschaft und Forschung zu erzeugen.
Der Autor: Jahrgang 1972; Abitur; Wehrdienst; Studium der Biochemie; Diplombiochemiker; zahlreiche Veröffentlichungen; Promotion. Marc Götz lebt und arbeitet bei der Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation als CSIRO-Officer Level 4 in Adelaide, Australien.
Geleitwort
Bei Höheren Pflanzen werden in den Blättern durch den Prozeß der Photosynthese Zucker produziert, die zu anderen Pflanzenteilen, wie Wurzeln, Blüten und Früchten, transportiert und dort als Nährstoffe verbraucht oder – nicht zuletzt auch zu unserem Nutzen – gespeichert werden. Dieses ernährungsphysiologische Mosaik ist nicht statisch; es wird entwicklungsabhängig reguliert und auch durch externe Faktoren wie die Infektion durch Pathogene beeinflußt. Die Aufklärung der Regulation der Kohlenhydratverteilung ist deshalb wichtig sowohl für das Verständnis von Wachstum, Entwicklung und Abwehrreaktionen von Pflanzen als auch für die Beeinflussung von Kohlenhydratflüssen in transgenen Pflanzen zur Steigerung der Ausbeute an Ernteprodukten und Erhöhung der Widerstandsfähigkeit.
Die molekularen Mechanismen zur Versorgung von Geweben mit Zukkern hat der Autor – Diplombiochemiker – exemplarisch an der Entwicklung und Keimung von Tabakpollen untersucht. Für diese Prozesse hat er fachkompetent eine essentielle Funktion des Enzyms »extrazelluläre Invertase«, das den Transportzucker Saccharose in die Hexosemonomere Fructose und Glucose spaltet, nachweisen können. Durch die Isolierung eines hochspezifisch regulierten Promotors, einer bisher nicht charakterisierten genetischen Steuerungseinheit, war ein eleganter kausalanalytischer Versuchsansatz möglich. Dabei wurde in transgenen Pflanzen die Aktivität der extrazellulären Invertase zelltypspezifisch reduziert. Bei den Analysen kam eine Kombination eines großen Spektrums anspruchsvoller molekularbiologischer, biochemischer und physiologischer Methoden zum Einsatz. Die Untersuchungen zeigen, daß die extrazellulären Invertasen unverzichtbar für die Versorgung von Verbrauchsorganen mit Kohlenhydraten sind. Zudem weisen die Befunde darauf hin, daß über die extrazelluläre Invertase auch die Verfügbarkeit von Zuckern als Signalmoleküle gesteuert wird. Diese Ergebnisse haben wichtiges biotechnologisches Anwendungspotential zur Herstellung männlich steriler Sorten für die Hybridsaatgutproduktion und zur Erzeugung ausbreitungsunfähiger Sicherheitslinien transgener Pflanzen.
Als wichtigen Regulator von extrazellulären Invertasen konnte der Autor Brassinosteroide identifizieren, eine neue Klasse von pflanzlichen Hormonen mit Steroidstruktur. Durch die Etablierung von photoautotrophen Tomatenzellkulturen als hochsensitives Testsystem und dem Nachweis der gewebsspezifischen Induktion der extrazellulären Invertase in Tomatensämlingen konnte erstmals eine Verknüpfung zwischen Kohlenhydratmetabolismus und Brassinosteroid-vermitteltem Streckungswachstum aufgezeigt werden. Damit tragen die Untersuchungen dazu bei, den molekularen Mechanismus der Brassinosteroid-Wirkung aufzuklären.
Aufgrund der anspruchsvollen Thematik und dem Anwendungspotential sollte das Buch neben den in der molekularen Pflanzenphysiologie tätigen Wissenschaftlern auch für einen breiten Kreis von pflanzenwissenschaftlich interessierten Lesern von großem Nutzen sein. Zusätzlich verdient die Monographie als umfangreiches Methodenkompendium besondere Beachtung.
Prof. Dr. Thomas Roitsch
Vorwort
Ich möchte mich auf diesem Weg bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, und die mich während des langen Weges bis zu diesem Punkt begleitet und unterstützt haben:
Vielen Dank an Prof. Dr. Thomas Roitsch für das spannende Thema, die Unterstützung und Motivation, die Diskussionen und Denkanstösse. Vor allem die Möglichkeit stets durch seine offene Tür gehen und mit ihm reden zu können war für mich sehr wichtig. Außerdem wünsche ich ihm viel Erfolg und alles Gute für die neue Aufgabe in Würzburg.
Herrn Prof. Dr. Widmar Tanner gilt mein besonderer Dank für sein Interesse an meiner Arbeit, die kritischen Fragen und Diskussionen und die Unterstützung die er mir zukommen ließ. All das ging weit über das normale Maß hinaus, das man als Mitarbeiter einer unabhängigen Arbeitsgruppe erwarten kann. Danke!
Einen besonderer Dank geht nach Paris an Dr. Anne Guivarc’h und Prof. Dr. Dominique Chriqui für die tollen Bilder der in situ-Hybridisierungen und Immunolokalisierungen und die fruchtbare und gute Zusammenarbeit. Außerdem vielen herzlichen Dank nach Bielefeld an Dr. Uwe Kahmann, der für uns die eindrucksvollen Elektronenmikroskop-Aufnahmen gemacht hat.
Allen aktuellen und ehemaligen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe möchte ich herzlich für das gute Arbeitsklima, die Ratschläge, Ideen und Diskussionen danken. Das gute Arbeitsklima hat das Arbeiten leicht gemacht. Vielen Dank an Dietmute, Rainer, Anja, Markus, Alok, Vinzenz, Jürgen, Reinhard, Tahira und Taek Kyun.
Ganz besonders danke ich Dr. Dietmute Godt, die wichtige Vorarbeiten für die Projekte meiner Arbeit geleistet hat und mir am Anfang geholfen hat wo sie konnte, damit ich mich in das Thema einfinde. Dr. Rainer Ehneß danke ich für die große Unterstützung und Hilfe, bei allen Problemen die im Labor aufgetreten sind. Vielen Dank an Reinhard für die Hilfe bei der Analyse des Promotors.
Vielen Dank auch an die TAs, Annemarie, Georgine, Gerlinde, Ina, Petra und Frau Herold, für die Unterstützung und Mitarbeit. Danke auch an die Hiwis und Praktikantinnen, Anja, Birgitt, Doris, Katharina, Monika und Jürgen, die zu betreuen mehr Vergnügen als Arbeit war und die gute Ergebnisse beigesteuert haben.
Auch allen anderen Mitarbeitern des Lehrstuhls danke ich für die gute Arbeitsatmosphäre und die Unterstützung mit Rat und Tat und allem was gerade ausgegangen war und aus einem Nachbarlabor geschnorrt werden mußte.
Ein riesengroßes Dankeschön geht an unseren Gärtner Herrn Günther Peißig. Nur dank seiner hervorragenden Betreuung hunderter Tabakpflanzen war diese Arbeit überhaupt möglich.
Danke auch an Stephan Buchhauser aus dem Photolabor, für die Diabelichtungen, Abzüge und Photoausdrucke, die er immer wieder auf wundersame Weise auch über Nacht für uns gemacht hat.
Vielen Dank an Prof. Dr. Uwe Sonnewald und Andrea Knospe vom IPK in Gatersleben, die mir bei den Problemen mit der Pflanzentransformation geholfen haben und mir die Technik genau erklärt und gezeigt haben.
Vielen Dank auch an Dr. Alisher Touraev und Julia Barinova vom Biocenter in Wien, die mir die in vitro Pollenmaturation beigebracht haben.
Danke an Prof. Dr. Thomas Rausch, für die Überlassung von Vektoren mit der cDNA des Invertase Inhibitors.
Außerdem Danke ich Prof. Dr. Adam für die Überlassung der Brassinosteroide.
Allen Korrekturlesern möchte ich dafür danken, daß sie ihre Zeit geopfert haben, um mir mit ihren Korrekturen und Kritiken zu helfen diese Arbeit zu vollenden. Insbesondere danke ich Karin für die Korrektur meiner miesen Interpunktion.
Danke auch an alle Freunde, die mich auf meinem Weg begleitet haben und für mich da waren, insbesondere an Ingeborg.
Der größte Dank geht an meine Eltern, die mich schon früh zur Selbständigkeit erzogen haben und mich meinen eigenen Weg haben gehen lassen, bei dem sie mich aber immer unterstützt haben.
Marc Götz
Aus dem Inhalt
Einleitung
1 Extrazelluläre Invertasen: Funktion und Regulation in höheren Pflanzen
2 Pollenentwicklung und männliche Sterilität
3 Brassinosteroide
4 Zielsetzung
Ergebnisse
1 Identifizierung einer spezifisch in Tabakblüten exprimierten Invertase und Untersuchungen zu ihrer Funktion bei der Pollenentwicklung und –keimung
1.1 Charakterisierung und Sequenzierung des genomischen Invertaseklons pNDG8
1.2 Analyse des spezifischen zeitlichen und räumlichen Expressionsmusters von Nin88
1.3 Klonierung des Nin88-Promotors und Überprüfung der korrekten Expression
1.4 Gewebespezifische Reduzierung von Nin88-Aktivität durch Antisense Repression oder einen Invertase-Inhibitor verursacht männliche Sterilität
1.4.1 Gewebespezifische Antisense Repression von Nin88
1.4.1.1 Phänotypische Charakterisierung der Antisense-Pflanzen
1.4.1.2 Morphologische Charakterisierung der Antisense-Pollen
1.4.1.3 Selektive Verringerung der Invertaseaktivität im Tapetum und in sich entwickelnden Pollen in den Antisense-Pflanzen
1.4.1.4 Untersuchungen zur Entwicklung der transgenen Pollen
1.4.2 Gewebespezifische Reduzierung der Nin88-Aktivität durch einen Invertase-Inhibitor
1.4.2.1 Phänotypische Charakterisierung der Inhibitor-Pflanzen
1.4.2.2 Morphologische Charakterisierung der Inhibitor-Pollen
1.4.2.3 Untersuchung der Invertaseaktivität in sich entwickelnden Pollen in den Inhibitor-Pflanzen
1.4.2.4 Extrazelluläre Invertaseaktivität während der Pollenkeimung
1.4.2.5 Zuckeraufnahme in Wildtyp- und Inhibitor-Pollen
1.5 Untersuchungen zur Samenproduktion in den Antisense-Pflanzen
1.5.1 Fremdbestäubung der Antisense-Pflanzen mit Wildtyp-Pollen
1.5.2 Expression von Nin88 in Fruchtknoten und Pollen
1.6 Antherenspezifische Expression des Nin88-Promotors in anderen Pflanzen
2 Klonierung von Hexosetransportern aus Tabakantheren
2.1 Klonierung und Sequenzierung von Hexosetransportern
2.2 Expressionsanalyse der Hexosetransporter Nt-Htp1 und Nt-Htp2
3 Gewebespezifische Induktion einer extrazellulären Invertase aus Tomaten durch Brassinosteroide
3.1 Die extrazelluläre Invertaseaktivität in photoautotrophen Tomatensuspensionskulturen wird durch Brassinosteroide erhöht
3.2 Brassinosteroide induzieren spezifisch die mRNA des extrazellulären Invertaseisoenzyms Lin6
3.3 Die Zuckeraufnahme in Suspensionskulturzellen wird durch Brassinosteroide stimuliert
3.4 Das lokalisierte, brassinosteroidabhängige Hypokotylwachstum von Tomatenkeimlingen korreliert mit einer gewebespezifischen Induktion der Lin6 mRNA
4 Etablierung einer schnellen und einfachen Methode zur Detektion nicht kovalent gebundener Pflanzenzellwand-Proteine
Diskussion
1 Analyse der Regulation und Funktion der extrazellulären Invertase Nin88
1.1 Klonierung der extrazellulären Invertase Nin88 und ihres Promotors aus Nicotiana tabacum
1.2 Nin88 besitzt ein spezifisches zeitliches und räumliches Expressionsmuster
1.3 Erzeugung männlich steriler Pflanzen durch Reduzierung der Nin88-Aktivität in Pollen
2 Spezifische Induktion der extrazellulären Invertase Lin6 durch Brassinosteroide
3 Ausblick
Material und Methoden
1 Material
1.1 Verwendete Organismen
1.1.1 Suspensionszellkulturen
1.1.2 Pflanzen
1.1.3 Escherichia coli-Stämme und Agrobakteriumstamm
1.2 Vektoren und Klone
1.3 Antikörper
1.4 Oligonukleotide
1.5 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien
1.6 Laborgeräte und Computersoftware
1.7 Puffer und Lösungen
1.7.1 Agarosegelelektrophorese
1.7.2 Agrobakterienminipreps
1.7.3 Bradford-Proteinbestimmungstest
1.7.4 DNA-Minipreps
1.7.5 Genomische DNA-Isolierung aus Pflanzen
1.7.6 Invertasetests
1.7.7 Pollenuntersuchungsmethoden
1.7.8 RNA-Isolierung und Northernblotanalysen
1.7.8.1 RNA-Isolierung
1.7.8.2 RNA-Gele, Blotting und Northern-Hybridisierung
1.7.9 SDS-Proteingele und Westernblotanalysen
1.7.9.1 Coomassie-Färbung von SDS-Proteingelen
1.7.9.2 SDS-Gele
1.7.9.3 Westernblot
1.8 Medien
1.8.1 Pflanzentransformationen
2 Methoden
2.1 Anzucht der Pflanzen, Behandlung und Ernte des verwendeten Pflanzenmaterials
2.1.1 Anzucht der Pflanzen
2.1.2 Anzucht der Suspensionskulturen
2.1.3 Ernte von Pflanzenmaterial
2.1.4 Behandlung der Suspensionszellen mit Testsubstanzen
2.1.5 Hypokotylwachstumstest mit Brassinosteroiden
2.2 Pflanzentransformationen
2.2.1 Transformation von Nicotiana tabacum
2.2.2 Transformation von Lycopersicon peruvianum
2.3 Molekularbiologische Methoden
2.3.1 Agrobakterien
2.3.1.1 Herstellung kompetenter Agrobakterien
2.3.1.2 Transformation von Agrobakterien
2.3.1.3 Agrobakterien Minipreps
2.3.2 Carrier-DNA
2.3.3 DNA-Agarosegelelektrophorese
2.3.4 DNA-Dephosphorylierung mit alkalischer Phosphatase
2.3.5 DNA-Fragmentisolierung aus LMP-Gelen
2.3.6 DNA-Ligation
2.3.7 DNA-Plasmid-Midipreps
2.3.8 DNA-Plasmid-Minipreps und Restriktionsenzymverdaue
2.3.9 DNA-Sequenzierung
2.3.10 Genomische DNA-Isolierung aus Pflanzen
2.3.11 Gewinnung von Antiseren gegen extrazelluläre Invertasen
2.3.11.1 Klonierung der Expressionsvektoren
2.3.11.2 Expression und Anreicherung der Fusionsproteine
2.3.11.3 Immunisierung von Kaninchen und Gewinnung von Antiseren
2.3.12 Herstellung der DNA-Standards für die Agarosegelelektrophorese
2.3.13 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen und Transformation
2.3.14 Northernblot-Analysen
2.3.14.1 RNA-Isolierung
2.3.14.2 RNA-Formaldehydgelelektrophorese
2.3.14.3 Northern-Blot
2.3.14.4 Hybridisierung
2.3.15 Pollenuntersuchungsmethoden
2.3.15.1 DAPI-Färbung
2.3.15.2 Histochemische GUS-Färbungen
2.3.15.3 in vitro Pollenkeimungstest
2.3.15.4 in vitro Pollenreifung
2.3.15.5 Stärkefärbung mit I2/KI-Lösung
2.3.15.6 Vitalitätstest
2.3.16 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
2.3.17 Primer-Annealing
2.3.18 Reverse-Transkription
2.3.19 RNA-in situ Hybridisierungen und Nin88-Immunolokalisation
2.3.20 Zuckeraufnahmemessungen
2.4 Biochemische und Proteinchemische Methoden
2.4.1 Aufnahmen mit dem Elektronenmikroskop
2.4.2 Bradford-Proteinbestimmungstest
2.4.3 Herstellung von Invertaseextrakten
2.4.4 Invertaseaktivitätstest
2.4.5 SDS-Proteingelelektrophorese und Westernblot
2.4.5.1 SDS-PAGE
2.4.5.2 Coomassie-Färbung von SDS-Proteingelen
2.4.5.3 Western-Blot
Anhang
1 Sequenz des Nin88-Promotors und identifizierte regulatorische Elemente
2 Genomische Sequenz von Nin88 mit der identifizierten Exon-Intron-Struktur
3 Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz der Exons I – IV von Nin88
4 Gesamtsequenz des genomischen Invertaseklons pNDG8
5 Teilsequenzen von extrazellulären Invertasen, die für die Konstruktion der Antisense- Konstrukte verwendet wurden
5.1 Teilsequenz aus Nin88
5.2 Teilsequenz aus Nt-bfruc1
5.3 Teilsequenz aus Cin1
6 Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenzen der klonierten Hexosetransporter aus Tabakantheren
6.1 Sequenzen von Nt-Htp1
6.2 Sequenzen von Nt-Htp2
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